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选择荧光定量PCR仪时的两个误区

发布时间:2022-05-11      点击次数:220
   荧光定量PCR仪是由荧光定量系统和计算机组成,用来检测循环过程中的荧光的仪器。它的用途非常广泛,常见的应用是基因工程研究领域和医学领域。比如:用于做基因表达研究、转基因研究、单核苷酸多态性(SNP)及突变分析、病原体检测、药物疗效考核、肿瘤基因检测、免疫组分析等等。
  
  选择荧光定量PCR仪时的两个的误区:
  误区一:仪器通道越多越好
  随着PCR技术的成熟运用,多重扩增越来越热闹,仪器也不能幸免。从开始推出的单通道发展到如今各个厂家都推出4通道、5通道甚至6通道,眼花缭乱的选择让人无所适从,就有人一不小心走进了“通道越多越好”的误区。
  
  在使用有些厂家5通道的荧光定量仪时,为了确保实验结果的精确性和准确性都要在实验中使用ROX(一种荧光染料)或专用的Referencedye,这些荧光染料都必须单独使用一个检测通道。这样以来,真正能检测多重PCR荧光信号的有效通道只有4个,而且使用校正染料可能会增加后期的使用成本。有的荧光定量PCR的检测通道是只为自已厂家的专用的荧光染料或试剂开放的,有效检测通道也绝非像宣传资料中宣称的那么多。在购买前确认荧光定量PCR仪器的有效检测通道尤为重要,不能单单只听宣传。
  
  考虑多重荧光定量PCR的通道数的时候也应该从实验室实际情况出发,多重PCR并非人人适用、人人可用,因为多重PCR必须要对退火温度进行优化,在引物设计的时候就可能开始考虑能不能放在一个反应体系内进行反应,不同的反应需要的退火温度不同,不合适的退火温度会降低扩增效率,放大非特异性扩增,甚至扩增不出来,它使实验指数倍的复杂化了。临床上因为有试剂厂家专门针对某些疾病开发研制的多重检测试剂盒,才需要用到3、4、5通道的检测;科研用的荧光定量因为设计探针麻烦,基本上都用染料法,基本上单通道就能满足。
  
  误区二:Real-TimePCR仪无需梯度功能
  对于使用染料法的定量PCR反应,虽然有各种各样的PCR引物设计软件或者经验公式计算熔解温度(Tm值),但运用的公式不同、引物序列不同,Tm值的差异会很大。引物的熔解温度决定了退火温度。而且模版中碱基的组合千变万化,对于特殊片断,经验公式得到的数据不一定能得出准确的结果,退火温度细微的差异对结果都可能产生决定性的影响,因而“摸条件”一度是让人很头疼的问题。梯度PCR的出现部分解决了一些问题——在反应过程中每个孔的温度控制条件可以在zhi定范围内按照梯度变化,根据结果,一步就可以摸索出适合的反应条件。不单退火温度,连变性温度和延伸温度都可以优化——对于多种聚合酶混合酶扩增如Invitrogen、Clontech、Promega的多数高保真Taq酶来说这个非常重要,因为Taq和校正酶的反应温度可能有显著差异,优化延伸温度就显得很重要。
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