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核酸提取仪原理与应用

发布时间:2022-06-18      点击次数:550

 

核酸提取仪"的原理

核酸提取仪的工作原理

目前核酸提取仪的工作原理主要分为磁珠法和柱法,其中磁珠法占据当前市场的主流地位。

磁珠的工作原理主要是利用磁珠对核酸的特异性识别和高效结合,通过磁珠吸附核酸达到分离效果。常见的磁珠类型包括氧化锆磁珠和二氧化硅磁珠。根据磁珠与液体的分离方法,提炼出磁选机法和抽吸法,其原理和过程相同。

核酸提取仪"的分类

根据不同类型的仪器。

1)自动液体工作站

自动液体工作站是一个非常强大的设备,它可以自动分配和吸取液体,甚至通过集成扩增和检测功能,实现标本提取、扩增和检测的全自动化。提取核酸只是其功能的一个应用,不适合常规的实验室提取核酸。一般适用于单一种类标本的实验要求,一次可抽取非常大量的标本(至少96个,一般为数百个)。自动化工作站平台的建立和运行需要相对较大的资金。

2)小型自动核酸提取仪

小型自动化仪器通过操作结构的特殊性,可以自动提取核酸,可以应用于任何实验室。

根据不同的提取原理。

1)仪器采用离心柱法

离心柱法核酸提取仪主要采用离心机和自动移液装置相结合的方法。通量一般为1-12个样品,操作时间与人工提取几乎相同。不能提高实际工作效率,而且贵。不同类型仪器的耗材不能通用,只适合资金充足的大实验室。

2)使用磁珠法的仪器

以磁珠为载体,基于磁珠在高盐低PH值下吸附核酸,在低盐高PH值下与核酸分离的原理,通过移动磁珠或转移液体即可实现核酸提取纯化的全过程。由于其原理的*性,可以设计成多种通量,单管或8-96个样品即可提取。而且其操作简单快捷,提取96个样品仅需30-45分钟,大大提高了实验效率,成本低廉。因此可以在不同的实验室使用,是目前市场上的主流仪器。

根据工作性质。

1)手工提取核酸存在操作步骤复杂、效率低、核酸纯度低等问题。


2)全自动核酸提取是利用匹配的核酸提取试剂快速提取样品核酸,具有操作简单、准确度高、稳定性强等优点。在此疫情中,高通量自动核酸提取仪在大规模人群核酸检测中发挥了重要作用。

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“核酸提取仪"的应用

核酸提取仪是生物分子相关分离纯化实验室中非常重要的仪器,可广泛应用于基因组学、疾病控制和医疗、临床诊断、法医鉴定等领域。

1.基因组学


无论提取样品的来源是微生物、动物、植物还是病毒,核酸提取仪结合试剂盒可以快速纯化足够数量和纯度的DNA或RNA。高质量的核酸可以满足下游应用的需要(如PCR/实时PCR、基因芯片、Southern印迹和Northern印迹)。


2.疾控中心疾病预防控制


基于全自动核酸提取仪的快速高通量技术,可用于解决甲型H1N1流感、儿童手足口病、麻疹病毒等的快速自动化疫情监测系统。,提高重大疫情的应对能力。


3.临床样本的分子诊断


该核酸提取纯化系统能够快速、高通量地处理临床样本,提取的核酸可用于后续的分子诊断。它也适用于福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)的组织样本。


4.畜牧兽医


它能高效、灵敏地提取新城疫病毒、猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、贝氏柯克斯体等。


5.法医学的应用


对于法医工作来说,核酸提取的效率和稳定性非常重要。核酸提取仪与法医样本核酸提取专用磁珠试剂配合使用时,可从包括烟头、发根、软骨、指甲等不同来源的材料中纯化出高质量的DNA。

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“核酸提取仪"常见问题及解决方法

1.磁棒核酸提取仪手工提取与电脑提取有显著差异。

磁棒式核酸提取仪通常使用磁性保护套(搅拌套)转移磁珠并均匀混合液体,深孔板底部使用加热模块加热深孔板孔内液体,从而模拟人工操作过程。手工提取的实验结果只能说明手工操作过程和试剂光环没有问题,转到仪器后要综合考虑。


磁珠法的一般操作流程:裂解、结合、洗涤、洗脱可在手工操作中分步实现。但为了限度避免人工操作,通常在一个孔内进行破解和组合。客户一般使用酒精作为粘接液,不仅稀释了裂解液,也影响了裂解效率。而且由于孔内液体温度上升,酒精挥发影响键合效率。另外,仪器一般采用底部加热方式,孔内温度无法以仪器设定温度为准,不同厂家的仪器加热效率也会有所不同。所以光这一步就要在电脑上优化系统。


2.磁棒核酸提取仪孔位置提取效率不同。


磁条型核酸提取仪一般用卡片或黄色钢球固定96孔深孔板,底部有槽形加热片。在进行加热条件下的实验时,如果深孔板的孔与底部的加热槽没有紧密贴合,会直接影响实验结果。这种安静的情况导致了孔间实验结果的不稳定。如果发现一个固定孔的提取结果总是与其他孔有较大差异,可以考虑仪器的加热模块是否有问题,观察该孔的上游裂孔是否有磁珠残留,用空白样品检查仪器在孔间的磁珠转移能力是否彻底。


3.磁棒核酸提取仪机器提取中加入的洗脱液体积与实际获得的核酸溶液体积不同。


目前市场上的磁棒核酸提取仪加热模块大多位于96孔深孔板的一、六、七、十二排。一排和七排大部分用作裂解和结合孔,而第六排和第十二排用作洗脱孔。因为大部分萃取实验在裂解结合步骤中需要加热,而第六排与第七排相邻,由于热传导效应的存在,使得热解加热时第六列洗脱液的温度也会升高,从而导致洗脱液的蒸发。因为洗脱液的体积很小(50μL-200μL),所以实际得到的核酸溶液的体积与加入的洗脱液系统的体积相差很大。


4.提取的核酸产量低。


A.样品体积与试剂的比例应控制在一定范围内,以免超过裂解能力。


B.粉碎和研磨的步骤。处理细节很重要。必须充分研磨,这是提取核酸的条件。


c、在洗脱步骤中,使用足够的洗脱剂进行洗脱并充分混合,以避免wjdtpod残留结块。


D.实验耗材要配套。比如不同的吸附柱或磁珠对核酸的吸附能力不同,也会影响核酸的产量。


5.提取的核酸被降解。


A.提取的样品量应符合试剂的比例,并尽量控制样品量达到适当的比例。


B.注意每一步都要充分均匀的混合,避免结块的残留影响实验结果。


C.在洗脱过程中,如果时间太长或温度太高,核酸可能会降解。


D.切记样品不要反复冻融,提取的样品要保存在适宜的温度下,长期保存尽量在-80℃。


6.提取的核酸纯度不够高。


A.样品量和试剂如裂解物的比例应尽可能控制在合适的范围内。


B.搅拌均匀,保证充分开裂,无块状残留物。


C.干燥的步骤要充分,否则可能会导致酒精等杂质的残留。


D.如果磁棒的振荡幅度过小或混合时间过短,磁珠上的杂质残留会影响磁珠吸附核酸的能力。

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“磁珠核酸提取仪"的常见误区

误区一:磁珠用的越多,提取效果会越好。

很多老师喜欢在提取效果差的时候加大磁珠的量。他们认为更多的磁珠可以吸附更多的核酸。不得不说,这种想法是不可取的。


磁珠的主要特点是在外加磁场的作用下,能以固态分散在液体中或从液体中分离出来。任何试剂体系,磁珠与液体的比例都应该有一定的阈值。如果超过一定的比例,太多的磁珠会失去分散特性,因为它们不能均匀分散在液体中,在洗涤过程中核酸磁珠和液体之间的接触效率不能充分增加。过多的磁珠也会吸附更多的杂质,对除杂效果影响很大。有时,过多的磁珠会吸附液体体系中起主要作用的蛋白酶、溶菌酶等功能成分,导致整个试剂盒效率低下。在很多情况下,当提取效果不好时,减少磁珠的用量是提高提取效果方法。


通常磁珠法试剂盒给出的参比磁珠量略过量,需要增加磁珠量以提高吸附效率的情况并不多。但是,如果确定由于磁珠量不足导致提取效果不好,则可以通过在一定范围内增加磁珠量来提高提取效果。


以GNT-02系列磁珠为例,提取常量样品(植物组织、全血等)时。),通常用量为10ul/次;提取微量样本(如血清游离DNA、口腔拭子等)时。),磁珠量应在15~20ul/次。如果需要超过这个使用量,需要和技术工程师沟通。


误区二:使用的试剂越多,提取效果越好。


破解效果不好?添加更多的裂解溶液。洗涤效果不好?添加更多洗涤液。这是很多客户在使用套件时的习惯思维。


但是对于磁珠法来说,每增加一部分液体体积,磁珠的碰撞几率就会降低,降低磁珠的碰撞几率会导致吸附率的大幅下降。所以在很多情况下,虽然增加裂解液和洗涤液确实可以增强裂解和洗涤,但磁珠提取的核心是磁珠吸附核酸的效率,不保证磁珠的碰撞效率就无法保证核酸提取的效率。因此,简单地增加用于改善提取效果的试剂的量可能不是完全有效的。


对于GNT-B02全血基因组DNA试剂盒,裂解液和洗涤液的量分别不得超过400微升/次和500微升/次。如果真的需要对系统进行放大,那么磁珠和样品的量也要相应增加,而且这个放大不一定是成比例的。


误区三:洗涤次数越多,萃取效果越好。


当提取的核酸中杂质过多时,用户会考虑多洗几次,以获得更纯的核酸。增加洗涤次数确实有利于核酸的纯化,但考虑到每次洗涤都会损失一定量的核酸,增加核酸裂解和水解的可能性,一般将洗涤次数控制在2~4次为宜。


对于GN系列试剂盒,单个净化试剂盒洗涤次数为2次,植物和动物试剂盒洗涤次数为3次,血液试剂盒洗涤次数为3~4次。


误区四:取样越多,提取效果越好。


当样品不够新鲜或者核酸含量本身较少时,核酸提取效果往往较差,很多老师会通过多取样品来增加核酸提取量。


但单纯增加样品量有时会导致杂质过多,超过裂解液的裂解能力,降低提取效率。因此,不建议单纯增加样本量来达到增加提取量的目的。


如果由于样品量不足,提取量确实太低,建议在开始提取前进行富集或浓缩步骤。或者增加切割的完全性以暴露更多的核酸也是一种解决方案。


误区五:如果某一种磁珠是好的,那么它应该在所有实验中都很好用。


磁珠的种类很多,不同的粒径、不同的分散性、不同的磁响应时间、不同的包被基基质、不同的外部修饰官能团、不同的包被密度、不同的官能团臂长,都会导致磁珠的特性不同。


所以不同的磁珠所适应的实验和系统是不一样的。就像同样一种提取核酸的试剂,配方不完全一样,用于提取核酸的磁珠性质也不完全一样。


有些磁珠在提取大核酸时表现出更高的吸附效率,有些磁珠更适合提取微量核酸。有些磁珠适用于酸性试剂体系,有些磁珠适用于碱性试剂体系。有些磁珠磁响应好但沉降速度快,比较适合磁棒自动提取仪;有些磁珠沉降速度慢,但磁响应时间长,更适合移液自动提取仪。


少数几种磁珠可以用于所有实验。除了固定的试剂盒,在大多数情况下,磁珠和试剂系统必须调整一段时间。


误区六:与某个套件相比,效果不好,就是磁珠不好。


很多客户在筛选磁珠的过程中,只是在成熟的试剂体系下,简单的更换等量的磁珠,来比较磁珠的效果。


这样很容易得出某些磁珠效果不好的结论,但实际上由于不同的磁珠适用于不同的体系和剂量,往往需要调整才能得到更好的提取效果。

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购买“核酸提取仪"

核酸提取仪常见的核心参数有:提取原理、机械原理、提取时间、样品通量、样品管容量、针尖头通量、针尖头数、接口、仪器重量、仪器尺寸等。同时,在购买核酸提取仪时,除了上述核心参数外,还需要考虑以下因素:

1.操作简单,使用方便。


每次提取时,操作人员只需做安装工作,布置孔板(提供提取所需的试剂)。整个提取过程不需要人工帮助,仪器自动完成,并尽可能配置中文界面,有利于学习仪器的使用和编辑程序,减少新操作人员的误操作,降低实验失败的风险。


2.高吞吐量、速度和便利性


根据不同的应用场景,可以实现一次快速处理尽可能多的样本,在短时间内完成提取,从而保证核酸提取的高效、快速和及时。


3.安全、环保、稳定、无污染。


操作中涉及的试剂盒和溶剂要尽量低,对人体无害。


4.低成本和开放平台


基于成本考虑,试剂耗材的消耗和供应周期在采购时也要考虑。尽可能选择适合不同厂家提取的不同规格耗材和试剂的兼容性高的仪器。

 

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